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Artigo Original

Estabelecimento de protocolo de glicerolação de membranas amnióticas para uso como curativo biológico

Establishing protocol glicerolação of amniotic membranes for use as a biological dressing

André Oliveira Paggiaro1; Mônica Beatriz Mathor2; Viviane Fernandes de Carvalho3; Eugenio Pólo4; Marisa Roma Herson5; Marcus Castro Ferreira6

RESUMO

INTRODUÇAO: Pesquisadores têm procurado explorar várias alternativas terapêuticas (substitutos dérmicos), biológicas ou sintéticas, capazes de assegurar condiçoes ideais ao leito da ferida que favoreça o processo de cicatrizaçao. Uma opçao de substituto dérmico menos oneroso é o uso de membranas amnióticas. Os curativos constituídos de âmnion formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais, aceleram a reepitelizaçao das lesoes e diminuem a dor local.
OBJETIVO: Estabelecer protocolo de processamento de membranas amnióticas em altas concentraçoes de glicerol.
MÉTODO: Foram obtidas três amostras de membranas amnióticas, que preenchiam os critérios de inclusao e que a gestantes concordaram em ceder o material para pesquisa.
RESULTADOS: Os exames de cultura do material no momento da captaçao demonstraram ausência de crescimento bacteriano ou de fungos. As sorologias das pacientes foram todas negativas.
CONCLUSAO: Neste trabalho, buscamos estabelecer um protocolo de conservaçao de membranas amnióticas baseado na glicerolaçao, pois se trata de um método de baixo custo, relativamente simples e de fácil estocagem do material. Este método apresenta como desvantagem a sua alta toxicidade celular, resultando em destruiçao das células do tecido, porém preserva a integridade estrutural tecidual, conforme demonstrado nos resultados macroscópicos e microscópicos obtidos neste estudo.

Palavras-chave: Queimaduras. Curativos biológicos. Pesquisa.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Researchers have attempted to explore various alternative therapies (dermal substitutes), biological or synthetic, capable of providing ideal conditions to the wound bed to promote the healing process. An option of dermal substitute less costly is the use of amniotic membranes. Dressings consist of amnion forms a protective barrier against environmental bacteria, accelerate reepithelialization of lesions and reduce local pain.
OBJECTIVE: To establish protocol processing of membranes in high concentrations of glycerol.
METHODS: Three samples were obtained from amniotic membranes who met the inclusion criteria and that the women agreed to donate the material for research.
RESULTS: The examinations of material culture at the time of capture showed no bacterial or fungal growth. The serology of the patients was all negative.
CONCLUSION:In this study, we establish a protocol for the conservation of membranes based on glycerol because it is a low-cost, relatively simple and easy storage of the material. This method presents the disadvantage of its high cell toxicity, resulting in destruction of tissue cells, but preserves the structural integrity of tissue as shown in the microscopic and macroscopic results of this study.

Keywords: Burns. Biological dressings. Research.

O objetivo primário do tratamento do grande queimado é Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de eliminar o tecido desvitalizado e cobrir prontamente a fe-Sao Paulo (BT-ICHCFMUSP), com o uso de esterilizaçao terminal rida, buscando evitar complicaçoes sépticas, metabólicas (irradiaçao) quando necessário, assegurando sua qualidade para e funcionais que uma lesao colonizada e aberta pode acarretar1. Em áreas de queimaduras de 2o grau superficial ou profunda, procuramos, ainda, proporcionar condiçoes locais ideais para a ocorrência eficiente dos fenômenos da cicatrizaçao e de reepitelizaçao espontânea no menor prazo de tempo. Evitando, assim, contaminaçoes bacterianas excessivas ou depósitos exagerados de matriz extracelular, que podem resultar em sequelas funcionais e estéticas tardias2.

Na medida em que se consolidam os conceitos de microambiente da ferida e da sua interaçao com os materiais de curativo, os pesquisadores têm procurado explorar várias alternativas terapêuticas (substitutos dérmicos), biológicas ou sintéticas, capazes de assegurar condiçoes ideais ao leito da ferida que favoreçam aos processos de cicatrizaçao e reepitelizaçao. No entanto, apesar da grande variedade de materiais existentes no mercado, a maior parte deles nao está disponível em nosso país, exigindo sua importaçao, com elevado custo para o sistema de saúde pública3.

Uma opçao de substituto dérmico menos oneroso é o uso de membranas amnióticas. Os curativos constituídos de âmnion formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais, aceleram a reepitelizaçao das lesoes e diminuem a dor local, por proteger as terminaçoes nervosas e reduzir a inflamaçao local3-6. O uso de membranas amnióticas frescas ou processadas para curativo biológico tem sido consagrado na literatura internacional pelos inúmeros trabalhos publicados nas últimas décadas.

Rejzek et al.7 utilizaram a membrana em 50 pacientes, em sua maioria com queimaduras de segundo grau, sendo que os curativos eram removidos em 15 dias, nao necessitando de outros cuidados; nesse estudo, os autores relataram menor formaçao de cicatrizes em relaçao ao tratamento com curativos convencionais. Ravishanker et al.8 observaram restauraçao em feridas superficiais em todos os 61 casos estudados, ocorridos entre 7 a 10 dias.

O desenvolvimento de técnicas para o processamento de membranas amnióticas em território nacional poderia consolidar mais uma opçao de tratamento ao paciente queimado. Entre os possíveis métodos de preservaçao de material biológico, o uso do glicerol em altas concentraçoes (> 85%) pode ser considerado como bastante atrativo aos Bancos de Tecidos, pois apresenta custo reduzido, torna os materiais biológicos menos antigênicos ao tornar as células nao viáveis, apresenta efeito antibacteriano e antiviral e permite a conservaçao dos tecidos por até 5 anos a -4ºC.

O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolo de processamento de membranas amnióticas em altas concentraçoes de glicerol (>85%) no Banco de Tecidos do Instituto Central do uso clínico.


MÉTODO

O projeto teve aprovaçao pela Comissao de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade de Sao Paulo.

Origem das membranas

As membranas foram provenientes de doaçoes voluntárias de três gestantes jovens (20-35 anos), com gestaçoes sem intercorrências, pós-partos cesárea com produtos normais, sem antecedentes médico-sociais que precluam essa doaçao e confirmadas como sorologicamente negativas após duas baterias de exames (no caso de HIV, hepatite B e C) para contato com HIV, hepatite B e C, HTLV e doença de Chagas.

Método de preparo das membranas

Após coleta estéril e separaçao do córion, as membranas amnióticas foram transportadas ao Banco de Tecido (BT-ICHCFMUSP). A partir desse momento, todo o manuseio ocorreu dentro da proteçao do fluxo laminar. Após sua higiene e coleta de amostras para provas microbiológicas, foram colocadas em soluçao salina com antibióticos (penicilina cristalina -1.000.000 U/L e sulfato de estreptomicina -1g/L), entre 6 a 12 horas, a 4oC. Em seguida, após a remoçao de resíduos remanescentes, as membranas foram expostas a soluçao de glicerol >85% com antibióticos e sob movimentaçao a 37oC, durante duas horas. Transcorrido esse intervalo de tempo, as membranas foram colocadas em soluçao fresca de glicerol >85%, abertas, apostas a papel de filtro e recortadas no formato desejado. Após amostragem do material para análise microbiológica (bactérias aeróbicas/anaeróbicas Gram +, Gram - e fungos), as membranas foram embaladas em material validado para essa finalidade e conservadas em 4oC. Metade de cada uma dessas membranas foi enviada ao Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares (IPEN) e submetida à esterilizaçao terminal por irradiaçao a 25 kGy por duas diferentes metodologias: aceleraçao de elétrons e radiaçao gama do Cobalto 60. Depois disso, as membranas foram reidratadas em soro fisiológico por 30 minutos, para observar se elas retomavam suas características biomecânicas iniciais.

Análise macroscópica e histológica das membranas

As membranas amnióticas foram divididas em três grupos:

I) gliceroladas e nao irradiadas;

II) gliceroladas e irradiadas a 25 kGy em acelerador de elétrons;

III) gliceroladas e irradiadas a 25 kGy em cobalto 60.

Amostras de membranas dos três grupos foram reidratadas e avaliadas macroscopicamente quanto a suas características físicas, após os diferentes tipos de processamento que foram submetidas.

Foram também enviadas amostras para inclusao em parafina, cortes e coloraçao com hematoxilina-eosina (HE) para análise em microscopia óptica.


RESULTADOS

Obtençao das membranas


Foram obtidas três amostras de membranas amnióticas, que preenchiam os critérios de inclusao e que as gestantes concordaram em ceder o material para pesquisa. Os exames de cultura do material no momento da captaçao demonstravam ausência de crescimento bacteriano ou de fungos. As sorologias das pacientes eram todas negativas.

Processamentodasmembranasamnióticas(glicerolaçao)

As três membranas amnióticas foram submetidas com sucesso ao processo de glicerolaçao, sendo estocadas a 4oC até que todos os resultados de cultura e sorologia se confirmassem negativos. Depois disto, foram divididas em três grupos, sendo que dois deles foram enviados ao IPEN para irradiaçao em acelerador e o outro em Cobalto 60.

Análise macroscópica e histológica das membranas

Em todos os três grupos, quando ainda conservadas em glicerol, as membranas amnióticas possuíam aspecto inelástico e brilhante (Figura 1). Uma vez removido o glicerol pela exposiçao em soluçao salina por 30 minutos, ocorreu o retorno da opacidade e da maior elasticidade do tecido, nos três grupos (Figura 2).


Figura 1 - Amnion glicerolado.


Figura 2 - Amnion após reidrataçao



Apesar do retorno da opacidade e da elasticidade nos três grupos, isto nao ocorreu igualmente entre eles. Pudemos reparar que as membranas nao irradiadas preservam muito mais as características mecânicas do tecido, sendo mais resistente à traçao, mais fáceis de serem manipuladas e esticadas e com coloraçao mais semelhante ao tecido fresco. Enquanto isso, as amostras irradiadas tanto por acelerador como Cobalto 60 geram membranas com alteraçoes significativas de sua resistência mecânica, pois acabam por romper com mais facilidade. Além disso, apresentam coloraçao mais acastanhada e sao extremamente difíceis de serem manipuladas e esticadas.

Pode-se ainda perceber que um dos lados da membrana é mais brilhante que o outro. O lado de maior brilho é aquele em que se encontra o epitélio do tecido. Isto deve ser informado ao usuário no momento do transplante, para que o tecido seja posicionado corretamente sobre a ferida, ou seja, com o epitélio voltado para cima.

Análise histológica

Na análise histológica, pudemos perceber que a membrana sem irradiaçao apresenta células epiteliais mais intactas com estrutura preservada e as lâminas conjuntivas sem vacuolizaçao e com pouca delaminaçao (Figura 3A). Em contrapartida, as membranas irradiadas apresentam células epiteliais mais deterioradas, com pequenas extensoes de membrana se soltando em áreas apicais e tecido conjuntivo com delaminaçoes mais perceptíveis (Figura 3B e C).


Figura 3 - A: sem irradiaçao; B: acelerador; C: Cobalto 60.



DISCUSSAO

A membrana amniótica é histologicamente muito similar à pele, uma vez que é originada do ectoderma embrionário, sendo um análogo à pele do embriao9. Assim, apresenta muitas das características da pele humana, podendo funcionar como barreira contra a invasao bacteriana, reduzir a perda de fluidos corpóreos e proteínas, aportar fatores de crescimento e moduladores da cicatrizaçao; enfim, restabelecer as condiçoes ideais para que os processos de cicatrizaçao progridam satisfatoriamente3.

A invasao bacteriana é um obstáculo importante para o processo de restauraçao, ao aumentar o processo inflamatório local10. Os curativos de membrana amniótica formam uma barreira protetora contra as bactérias ambientais. O efeito antimicrobiano parece ocorrer devido ao contato íntimo da membrana com a ferida, promovendo uma inibiçao bacteriana por contato11; ou, ainda, a restauraçao da microcirculaçao local permitiria um turn-over acentuado de fagócitos e de fatores bacteriostáticos séricos5.

Um efeito importante e frequentemente relatado com o uso de membranas amnióticas é sua capacidade em acelerar a reepitelizaçao das feridas12. As células do âmnio produzem e liberam diversos fatores de crescimento: fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento transformador, fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento do hepatócito, fator de crescimento neural e fator de crescimento vascular endotelial. Todos esses fatores foram apontados como a causa da influência positiva da membrana amniótica sobre a proliferaçao epitelial9, mesmo que as células do âmnion sejam destruídas em vários protocolos de conservaçao8.

Ao proteger as terminaçoes nervosas, prevenir a invasao bacteriana, diminuir a inflamaçao local, manter a hidrataçao local ideal e, principalmente, reduzir o número de trocas do curativo, o âmnio é capaz de promover uma ferida menos dolorosa1,4. Considerandose que a incidência de queimaduras na infância é alta, esse pode ser um argumento importante para sua eleiçao como curativos em crianças. Ravishanker et al.8 relataram que as crianças se acalmavam logo após a aplicaçao da membrana e os adultos afirmavam que o alívio era muito significante comparado com os curativos convencionais, com os quais 80% de seus pacientes queixavam-se de dor e desconforto.

Apesar dessas vantagens, sua principal desvantagem reside no fato de ser um material biológico, de origem humana. Consequentemente, pode ser um veículo potencial de doenças infectocontagiosas. Para reduzir ao grau mínimo o risco de transmissao de doenças infectocontagiosas através das membranas, é rotineiramente realizada a triagem das doadoras seguindo-se protocolos internacionalmente reconhecidos. Esses protocolos incluem a investigaçao de fatores de risco, determinados através do histórico médico-social e da realizaçao de testes sorológicos que afastem o risco de HIV, hepatites B e C, HTLV, sífilis e, em nosso meio, doença de Chagas. Os exames sorológicos para a detecçao de HIV e hepatite B e C sao repetidos novamente transcorridos seis meses da doaçao, com o intuito de eliminar janelas de risco biológico.

Ainda, sao aceitas membranas fetais apenas de partos cesárea, de parturientes sem histórico de doenças ginecológicas (ex: endometrite ou doença inflamatória pélvica, endometriose, etc), alteraçoes patológicas na gestaçao (exemplo: ruptura prematura da bolsa, toxemia, sinais de sofrimento fetal, mecônio, etc) ou suspeita e sinais de malformaçao congênita do concepto. As membranas sao testadas, ainda, quanto a possíveis contaminaçoes bacterianas e fúngicas, sendo que fazem parte dos protocolos de conservaçao, a adiçao de medidas bactericidas e bacteriostáticas, tais como banhos em agentes antissépticos.

Sabe-se que alguns tipos de processamento dos tecidos podem gerar exposiçao a agentes virucidas e bactericidas, reduzindo o risco de transmissao de agentes infecciosos. Em seu estudo, Van Baare et al.13 observaram que a conservaçao de pele em glicerol 70% ou 85% é capaz de inativar o HIV-1 intra e extracelular.

A glicerolizaçao foi descrita pela primeira vez por Basile14, em 1982, para preservaçao de pele de porco. O glicerol desidrata a pele, removendo o fluido intracelular. Porém, ele nao altera a concentraçao de íons das células, mantendo, dessa forma, a integridade estrutural do tecido e servindo como um método de preservaçao. Após reidrataçao em soro fisiológico, o tecido recupera sua pliabilidade7.

Neste trabalho, buscamos estabelecer um protocolo de conservaçao de membranas amnióticas baseado na glicerolaçao, pois se trata de um método de baixo custo, relativamente simples e de fácil estocagem do material. Apresenta como desvantagem a sua alta toxicidade celular, resultando em destruiçao das células do tecido; porém, preserva a integridade estrutural tecidual conforme demonstrado em nossos resultados macroscópicos e microscópicos.

Como resultado de sua citotoxidade, o glicerol em altas concentraçoes provoca um efeito benéfico, pois apesar de ser considerado um clássico método de preservaçao, ele acarreta também a destruiçao de vírus e bactérias, ocasionando um efeito sinérgico esterilizante do material. Gajiwala & Gajiwala4 utilizaram, como método de preservaçao, a exposiçao ao glicerol 85% e armazenamento a 4ºC, relatando a ausência de crescimento bacteriano por mais de um ano.

Apesar desse efeito "esterilizante", a maior parte dos Bancos de Tecido do mundo só considera o tecido completamente estéril quando submetido a um processo complementar de esterilizaçao. Atualmente, o mais consagrado na literatura é a radioesterilizaçao, que pode ser realizada por dois mecanismos principais: o acelerador de elétrons e as fontes de Cobalto 60. Em nossos estudos, submetemos amostras de âmnions gliceroladas a essas duas fontes de energia, nao sendo encontradas diferenças significativas entre os dois, tanto macro como microscopicamente. Porém, quando se compara o tecido nao irradiado com o irradiado, percebem-se diferenças claras entre os tecidos.

O material nao irradiado apresenta um epitélio e estruturas do tecido conjuntivo mais intactas quando comparados ao irradiado. Essas alteraçoes estruturais podem gerar resultados clínicos menos favoráveis, entretanto, o tecido transplantado oferece muito maior segurança ao indivíduo receptor. Dessa forma, o Banco de Tecidos deve levar em consideraçao todas essas informaçoes para indicar o uso de radioesterilizaçao complementar. Em nosso caso, indicamos só para aqueles materiais comprovadamente contaminados com bactérias gram positivas, que podem ser eliminadas pela irradiaçao. Enquanto isso, para as bactéria gram negativas contraindica-se a radioesterilizaçao, pelo risco da liberaçao de fatores pirogênicos.

O estabelecimento de um protocolo de processamento de membranas amnióticas em um Banco de Tecidos é fundamental para que este possa fornecer um tecido com rigoroso controle de qualidade, garantindo a menor possibilidade de riscos ao usuário. Em um país como o nosso, com extremas dificuldades financeiras para sustentabilidade da saúde pública, o uso das membranas amnióticas gliceroladas surge como um promissor método de substituto cutâneo de baixo custo e alta disponibilidade para o tratamento de pacientes queimados.


REFERENCIAS

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13. van Baare J, Cameron PU, Vardaxis N, Pagnon J, Reece J, Middelkoop E, et al. The 1998 Lindberg Award. Comparison of glycerol preservation with cryopreservation methods on HIV-1 inactivation. J Burn Care Rehabil. 1998;19(6):494-500.

14. Basile AR. A comparative study of glycerinized and lyophilized porcine skin in dressings for third-degree burns. Plast Reconstr Surg. 1982;69(6):969-74.










1. Médico Assistente da Unidade de Queimaduras da Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo (HCFMUSP), SP, Brasil.
2. Doutora em Tecnologia Nuclear Básica pela Universidade de Sao Paulo; Pesquisadora do Instituto de Pesquisas Nucleares (IPEN), Sao Paulo, SP, Brasil.
3. Doutora em Ciências da Saúde pela Disciplina de Cirurgia Plástica da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo (FMUSP), Sao Paulo, SP, Brasil.
4. Enfermeiro do Banco de Tecidos da Divisao de Cirurgia Plástica do HC-FMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.
5. Médica; Doutora em Clínica Cirúrgica pela FMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.
6. Médico; Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica da FMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.

Correspondência:
André Oliveira Paggiaro Av. Dr. Arnaldo, 455 - sala 1363
Sao Paulo, SP, Brasil - CEP: 01246-903
E-mail: andrepaggiaro@yahoo.com.br

Artigo recebido: 11/7/2012
Artigo aceito: 1/9/2012

Trabalho realizado na Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil.

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