RESUMO

INTRODUÇAO: A presença de úlceras em membros inferiores é uma das graves complicaçoes do diabetes melito. Cerca de 15% dos diabéticos estao propensos a desenvolver úlcera de membros inferiores, o que pode levar a amputaçoes desses membros. Ulceras nos diabéticos sao de difícil cura, em decorrência de anormalidades celulares e moleculares existentes no tecido de granulaçao dessas feridas. Tais fibroblastos podem apresentar dificuldades de proliferaçao in vitro, explicando os achados clínicos de cronicidade ferida. Neste estudo pretendemos comparar a proliferaçao celular in vitro de fibroblastos derivados de úlceras diabéticas com fibroblastos naodiabéticos oriundos de pele normal.

MÉTODO: Fibroblastos foram isolados a partir de amostras de tecido de granulaçao de cinco indivíduos portadores de úlceras diabéticas e comparados a fibroblastos obtidos amostras de pele íntegra de cinco indivíduos nao-diabéticos. As células foram cultivadas em monocamadas durante 27 dias e sua capacidade proliferativa foi analisada em intervalos de 3-4 dias.

RESULTADOS: Foi observado que fibroblastos originados de úlceras diabéticas apresentaram proliferaçao reduzida após 27 dias de cultura celular, quando comparado aos fibroblastos oriundos de pele normal (controle), mas essa diferença nao foi estatisticamente significativa (p=0,113).

CONCLUSAO: Apesar de nao haver diferenças matemáticas entre as proliferaçoes de fibroblastos de ambas as origens, diferenças fisiológicas e morfológicas foram observadas no comportamento das células estudadas.

Palavras-chave: Pé diabético. Diabetes mellitus. Proliferação de células. Fibroblastos.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Lower extremity ulceration is one of the serious diabetic complications. About 15% of diabetic patients are supposed to develop lower limb ulceration what may lead to amputations. Ulcers associated with diabetes are recalcitrant to healing due to cellular and molecular abnormalities, present in this pathology. It has been described behavioral changes in fibroblasts which are responsible for the granulation tissue formation. Under experimental conditions those fibroblasts can present difficulties to proliferate, explaining the clinical findings of wound chronicity. Our purpose in this study was to investigate the fibroblasts from diabetic patients in cell cultures, comparing with non-diabetic skin fibroblasts.

METHODS: Cells were taken and isolated from five diabetic ulcers granulation tissue and compared to those taken from five non-scarred non-diabetic skin samples. Cells were grown in monolayers during 27 days and their proliferative capacity was analyzed at 3 to 4 days intervals.

RESULTS: Fibroblasts from diabetic ulcers presented reduced proliferation after 27 days of cell culture when compared to fibroblasts from normal skin (control), but this difference was not statistically significant (p=0.113).

CONCLUSION: Despite no mathematical differences were observed between the proliferations of fibroblast from both origins, physiologic and morphologic differences were seen in the cell behavior.

Keywords: Diabetic foot. Diabetes mellitus. Cell proliferation. Fibroblasts.

O diabetes melito (DM) tem assumido proporçoes epidêmicas mundiais. Mais de 170 milhoes de pessoas sao afetadas no mundo todo. Especialistas em saúde estimam que existam 366 milhoes de indivíduos diabéticos em 2030. Esta projeçao é atribuída ao crescente envelhecimento da populaçao; ao próprio crescimento populacional; ao processo de urbanizaçao; à crescente prevalência da obesidade humana e ao sedentarismo1.

No Brasil, o último estudo publicado foi realizado entre 1986 e 1988, em nove capitais e estimou a prevalência média de diabetes na populaçao adulta em 7,6%2. Enquanto a média na populaçao mundial em 2000 foi estimada em 2,8%1.

O DM é uma condiçao primariamente definida por hiperglicemia, resultante de defeitos na secreçao de insulina e/ou de sua açao3,4.

Dentre as diversas complicaçoes da doença, a úlcera de membros inferiores (fenômeno clinicamente tao característico que recebeu a denominaçao de "pé diabético") representa o principal problema de saúde, social e econômico em todo o mundo5,6. Frequentemente está associada a dor, limitaçao física, terapias prolongadas e onerosas. Aproximadamente 15% dos diabéticos estao sujeitos ao desenvolvimento de úlceras, que precede 84% de todas as amputaçoes nao-traumáticas de membro inferior7,8. Estima-se que a cada 30 segundos um membro inferior seja amputado em alguma parte do mundo como consequência desta afecçao9.

Essas ulceraçoes sao frequentes em portadores de neuropatia periférica e/ou doença vascular periférica10. Atrofia dérmica (que pode predispor à formaçao de feridas) ou retardo no processo de cicatrizaçao sao comuns nesses pacientes. Além de isquemia local, presença de infecçao e hipertensao arterial sao alguns dos fatores que contribuem para o surgimento de tais lesoes. Fatores de risco intrínsecos podem nao ter relaçao causal com o diabetes, porém contribuem para a formaçao das úlceras11.

Tais úlceras sao recalcitrantes à cura devido a anormalidades celulares e moleculares5. Com base em observaçoes clínicas, essas úlceras apresentam tecido de granulaçao pobre12, processo de epitelizaçao atrasada, processo inflamatório persistente e sinais de infecçao por microrganismos13.

Em condiçoes experimentais, fibroblastos podem apresentar dificuldades para se multiplicar, explicando achados clínicos de cronicidade da úlcera14. Essa diminuiçao da proliferaçao e a senescência celular têm sido observadas em feridas crônicas15, porém ainda há grande controvérsia, na literatura, entre estudos in vitro da capacidade proliferativa de fibroblastos oriundos de feridas crônicas16.

Para melhor compreender o comportamento de feridas, em particular as úlceras diabéticas, a Divisao de Cirurgia Plástica da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo formou um grupo especial multidisciplinar17 para submeter essas úlceras a tratamentos com novas tecnologias, como o método de pressao negativa que aumenta a produçao de células no leito da ferida18, assim como estudar a influência da neuropatia na formaçao e perpetuaçao dessas19. Como consequência natural da investigaçao clínica, levamos as biopsias do leito de feridas diabéticas para o laboratório (LIM), onde já realizávamos cultura de células da pele, os queratinócitos20 e fibroblastos a partir de pele normal e cicatriz21.

Neste primeiro estudo, desenvolvemos as bases para a cultura de fibroblastos de úlceras diabéticas e comparamos a proliferaçao celular destes fibroblastos com fibroblastos derivados de indivíduos nao-diabéticos sem úlcera.


MÉTODO

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, sob o número 0380/08. Todos os pacientes foram informados sobre a finalidade e as consequências do estudo, e entao foi solicitada autorizaçao para participaçao do estudo e preenchimento do termo de consentimento informado.

Biopsias do tecido de granulaçao de úlceras em membros inferiores foram realizadas em cinco pacientes adultos do Ambulatório de Cirurgia Plástica HCFMUSP, portadores de diabetes mellitus tipo 2 ,que apresentavam feridas por mais de três meses, sem sinais aparentes de infecçao. Amostras de pele normal foram obtidas de cinco mulheres nao-diabéticas submetidas a cirurgias estéticas para reduçao de mama e que doaram o excesso de pele para fins de pesquisa.

Usando a técnica de explante proposta por Carrel, as culturas de fibroblastos primários foram obtidas a partir de amostras de pele humana normal (NHF) e de tecido de granulaçao das feridas crônicas (DMHF). Os explantes foram cultivados em frascos de cultura de 25 cm² de superfície (TPP 90.025), em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM - GIBCO 11.965,092), contendo 2 mM de glutamina (GIBCO 25.030,081), 100 U/mL penicilina, 100 mg de estreptomicina/mL e 25 mg mL de anfotericina B (antibiótico antimicótico - GIBCO 15.249,062) em 10% de soro fetal bovino (FCS - GIBCO 16.000,044) (nomeado como D₁₀) à 37ºC em uma atmosfera de 5% CO₂ umidificado.

A proliferaçao celular foi avaliada durante 27 dias a partir do dia do explante, com subpassagens em intervalos de 3-4 dias. Em cada passagem, o número de células foi contado em câmara hemocitométrica de Neubauer. Foi considerado como resultado a média aritmética dos valores obtidos ± erro padrao.

Os resultados foram estatisticamente analisados usando o teste ANOVA para amostras paramétricas. Foi adotado como válido p-valor de 0,05.


RESULTADOS

No grupo úlcera diabética, de um total de 37 biopsias realizadas, apenas cinco amostras apresentaram replicaçao de fibroblastos suficiente para realizar o ensaio de proliferaçao.

Foram observadas diferenças morfológicas entre os dois grupos de células no microscópio óptico. Fibroblastos de tecido de granulaçao de feridas sao maiores e menos fusiformes que fibroblastos da pele normal (Figura 1).




Com o tempo, ambos os grupos apresentaram aumento significativo no número de células (p = 0,008). Os fibroblastos derivados de feridas de membros inferiores dos pacientes diabéticos nao apresentaram reduçao estatisticamente significativa no número de células quando comparados aos fibroblastos de pele normal (controle) (p = 0,113). Há aumento do número de células de forma semelhante em ambos os grupos (p = 0,485), mas após 21 dias esse aumento se torna mais significativo no grupo HFN, embora a análise estatística entre as curvas nao revele diferenças significativas, como demonstrado na Figura 2.




Apesar da ausência de diferenças significativas no número de fibroblastos entre os grupos, houve tendência de aumento na proliferaçao celular após 21 dias no grupo NHF. Esse aumento nao foi significativamente diferente do grupo DMHF devido à variabilidade no comportamento individual, como demonstrado na Figura 3.




Na Figura 3A, dois indivíduos (pacientes 3 e 4, ou seja, 40% da amostra) apresentaram desempenho de proliferaçao muito diferente do restante do grupo. Por essa razao, houve grande variaçao entre as amostras, afetando a comparaçao com o grupo controle. Na Figura 3B, podemos observar maior homogeneidade entre as performances da proliferaçao de células individualmente.


DISCUSSAO

DM, há muito considerada uma doença de menor importância para a saúde no mundo, está agora a tomar o seu lugar como uma das principais ameaças para a saúde humana no século XXI6. O DM é conhecido por levar, prematuramente, a mudanças de maior intensidade que normalmente sao observadas nas doenças degenerativas associadas ao processo de envelhecimento humano22. Formaçao de úlcera dos membros inferiores e processo de cicatrizaçao tardio sao comuns nesses pacientes10.

Defeitos de cicatrizaçao de feridas em pacientes diabéticos podem ser explicados, em grande parte, pela presença de células disfuncionais5. Na microscopia óptica, fibroblastos de feridas diabéticas apresentam anormalidades morfológicas, tais como alargamento das células e a presença de vacuolizaçao citoplasmática (fenótipo hipertrófico). Essas alteraçoes sao semelhantes à senescência celular com irregularidades de membranas citoplasmáticas. Essas características sugerem que o ambiente da ferida seria responsável por modificaçoes celulares12. Em nossos experimentos, os fibroblastos de tecido de granulaçao de úlceras diabéticas observados, na microscopia óptica, eram maiores e menos fusíformes quando comparado aos fibroblastos da pele normal (Figura 1).

Contrariando os resultados apresentados por Loots et al.14 e outros autores23,24, que demonstraram diferenças estatísticas na proliferaçao celular comparando fibroblastos derivados de úlcera diabética e de pele normal, nossos resultados nao demonstraram diferença significativa na análise estatística da média. Muitos fatos podem explicar estes nossos achados.

Acreditamos que a técnica de explante proposta por Carrel (nossa escolha para a obtençao de células) é menos "agressiva" para as células que a obtençao por digestao enzimática, devido ao efeito menos deletério de enzimas, como a tripsina, sobre essas células. O contato entre as células da ferida diabética e a tripsina também pode causar alguns danos a essas células frágeis25, o que pode significar que a digestao enzimática pode também interferir na proliferaçao celular.

A digestao enzimática do fragmento de pele inicia o ensaio de proliferaçao de um número definido de células, enquanto a técnica de explante conta, num primeiro momento, somente com as células que se soltam do fragmento de pele. Ressalta-se que o cultivo de fibroblastos de úlceras diabéticas é difícil e frequente contato enzimático poderia selecionar fibroblastos "nao reais" do diabético, pois estes já passaram por uma "seleçao" promovida pela digestao enzimática.

Em geral, estudos in vitro sao analisados com três a cinco amostras diferentes de células por grupo, representatividade e reprodutibilidade dos resultados exigiria amostras maiores, o que nao é fácil de conseguir, por isso a dificuldade de estabelecer métodos in vitro que retratem idealmente o comportamento in vivo de fibroblastos.

Outro evento observado em neste estudo foi o grande número de culturas com falta ou escassez de células, às vezes, um atraso na proliferaçao de fibroblastos derivados de feridas também foi notado, o que resultou na inviabilidade da realizaçao dos experimentos envolvendo essas células. Por estas razoes, contamos com apenas cinco indivíduos do grupo de feridas diabéticas.

A manutençao da contagem de proliferaçao celular por mais tempo do que o período investigado, provavelmente, apresentaria diferença estatística entre proliferaçoes celulares de ambos os grupos, uma vez que tendência de progressao exponencial foi verificada no grupo controle, enquanto que nos fibroblastos do grupo feridas diabéticas a progressao observada foi muito discreta (Figura 2 - DMHF = 1x106 e NHF = 2.8x106). No entanto, foi adotado os 27 dias para interromper este ensaio para excluir interferências como múltiplas passagens nas cultura de células, modificaçoes ou alta mortalidade por apoptose ou, ainda, senescência celular (dados nao comprovados). Várias anormalidades no comportamento de células têm sido correlacionadas com a reduçao no número de células e cicatrizaçao prejudicada nos diabéticos, entre eles há o envelhecimento celular induzido pelo próprio fenômeno do diabetes (envelhecimento intrínseco)14.

Uma das principais preocupaçoes em culturas de células retiradas de áreas colonizadas por bactérias, tais como feridas crônicas, é o risco de infecçao. Embora protocolos de anti-sepsia rigorosa sejam utilizados para obtençao de amostras de tecido vivo e na descontaminaçao de fragmentos de tecido, contaminaçao da cultura pode acontecer26, principalmente em feridas diabéticas27, como observado neste estudo.

Portanto, é possível que o desbridamento cirúrgico possa corrigir algumas das anomalias presentes em feridas diabéticas28. Tem sido demonstrado que a limpeza cirúrgica, transformar uma ferida crônica em aguda que iria melhorar o processo de cicatrizaçao, quando comparada a feridas nao desbridadas. Essa explicaçao nao se baseia apenas na remoçao de tecidos necróticos, mas também na exposiçao de células presentes no interior da ferida, que sao biologicamente capazes de responder aos estímulos de cura. Acredita-se que, no ambiente da ferida, existem células com diferentes intensidades de respostas à cicatrizaçao, o que torna difícil compreender o papel do envelhecimento e da proliferaçao de fibroblastos alterados29. Entao, enfrentamos um dilema, ou limpar vigorosamente o leito da ferida, para evitar altos níveis de contaminaçao bacteriana, arriscando-se a alterar as características dos fibroblastos obtidos, ou preservar, tanto quanto possível, o leito dessa ferida, correndo o risco de perder nossas culturas devido à infecçao bacteriana. É por isso que das 36 biopsias procedidas obtivemos apenas cinco amostras de fibroblastos de úlcera diabética.

Mesmo que a capacidade de replicaçao das células entre em declínio, alguns raros clones de fibroblastos com potencial de replicaçao preservado continuam a existir nas culturas celulares. Portanto, a proliferaçao in vitro pode refletir apenas a propagaçao expansiva das maiores clone sobreviventes16.

Assim, tendo em vista os resultados controversos obtidos neste estudo, é necessária a realizaçao de estudos adicionais como life span, para melhor compreensao do comportamento proliferativo desses fibroblastos, o que indiretamente avalia sua capacidade de cicatrizaçao de feridas em indivíduos diabéticos.


REFERENCIAS

1. Wild S, Roglic G, Green A, Sigree R, King H. Global prevalence of diabetes. Diabetes Care. 2004;27(5):1047-53.

2. Malerbi D, Franco LJ. Multicenter study of the prevalence of diabetes mellitus and impaired glucose tolerance in the urban Brazilian population aged 30-69 years. Diabetes Care. 1992;15(1):1509-16.

3. World Health Organization. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia. Report of a WHO consultation. Geneva:WHO;2006.

4. Gross JL, Silveiro SP, Camargo JL, Reichelt AJ, Azevedo MJ. Diabetes mellitus: diagnóstico, classificaçao e avaliaçao do controle glicêmico. Arq Bras Endocrinol Metab. 2002;46(1):16-26.

5. Lobmann R, Schultz G, Lehnert H. Proteases and the diabetic foot syndrome: mechanisms and therapeutic implications. Diabetes Care. 2005;28(2):461-8.

6. Rathur HM, Boulton AJM. The neuropathic diabetic foot. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007;3(1):14-25.

7. Reiber GE, Vileikyte L, Boyko EJ, del Aguila M, Smith DG, Lavery LA, et al. Causal pathways for incident lower-extremity ulcers in patients with diabetes from two settings. Diabetes Care. 1999;22(1):157-62.

8. Reiber GE, Boyko EJ, Smith DG. Lower extremity foot ulcers and amputations in diabetes. In: Harris MJ, Stern MP, eds. Diabetes in America. Bethesda:US Government Printing Office;1995. p.409-28.

9. International Diabetes Federation. Time to act: diabetes and foot care. Brussels:International Diabetes Federation;2005.

10. Varani J, Perone P, Merfert MG, Moon SE, Larkin D, Stevens MJ. All-trans retinoic acid improves structure and function of diabetic rat skin in organ culture. Diabetes. 2002;51(12):3510-6.

11. Frykberg RG. Epidemiology of diabetic foot: ulceration and amputation. Adv Skin Wound Care. 1999;12(3):139-41.

12. Sibbald RG, Woo KY. The biology of chronic foot ulcers in persons with diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 2008;24(Suppl 1):S25-S30.

13. Acosta JB, del Barco DG, Vera DC, Savigne W, Lopez-Saura P, Nieto GG, et al. The pro-inflammatory environment in recalcitrant diabetic foot wounds Int Wound J. 2008;5(4):530-9.

14. Loots MA, Lamme EN, Mekkes JR, Bos JD, Middelkoop E. Cultured fibroblasts from chronic diabetic wounds on the lower extremity (noninsulin- dependent diabetes mellitus) show disturbed proliferation. Arch Dermatol Res. 1999;291(2-3):93-9.

15. Wall IB, Moseley R, Baird DM, Kipling D, Giles P, Laffafian I, et al. Fibroblast dysfunction is a key factor in the non-healing of chronic venous leg ulcers. J Invest Dermatol. 2008;128(10):2526-40.

16. Maier AB, Westendorp RG. Relation between replicative senescence of human fibroblasts and life history characteristics. Ageing Res Rev. 2009;8(3):237-43.

17. Ferreira MC, Tuma Jr P, Carvalho VF, Kamamoto F. Complex wounds. Clinics. 2006;61(6):571-8.

18. Ferreira MC, Carvalho VF, Kamamoto F, Tuma Jr P, Paggiaro AO. Negative pressure therapy (vacuum) for wound bed preparation among diabetic patients: case series. Sao Paulo Med J. 2009;127(3):166-70.

19. Carvalho VF, Ferreira MC, Vieira SA, Ueda T. Cutaneous sensibility threshold in the feet of diabetic patients with pressure specified sensory device: an assessment of the neuropathy. Rev Assoc Med Bras. 2009;55(1):29-34.

20. Kamamoto F, Paggiaro AO, Rodas A, Herson MR, Mathor MB, Ferreira MC. A wound contraction experimental model for studying keloids and wound-healing modulators. Artif Organs. 2003;27(8):701-5.

21. Isaac C, Mathor MB, Bariani G, Paggiaro AO, Herson MR, Goldenstein- Schainberg C, et al. Pentoxifylline modifies three-dimensional collagen lattice model contraction and expression of collagen types I and III by human fibroblasts derived from post-burn hypertrophic scars and from normal skin. Burns. 2009;35(5):701-6.

22. Vracko R, Benditt EP. Restricted replicative life-span of diabetic fibroblasts in vitro: its relation to microangiopathy. Fed Proc. 1975;34(1):68-70.

23. Hehenberger K, Heilborn J, Brismar K, Hansson K. Inhibited proliferation in fibroblasts derived from chronic diabetic wounds and in normal dermal fibroblasts treated with high glucose is associated with increased formation of l-lactate. Wound Repair Regen. 1998;6(2):135-41.

24. Hehenberger K, Hansson A, Heilborn JD, Abdel-Halim SM, Ostensson CG, Brismar K. Impaired proliferation and increased L-lactate production of dermal fibroblasts in the GK-rat, a spontaneous model of non-insulin dependent diabetes mellitus. Wound Repair Regen. 1999;7(1):65-71.

25. Huang HL, Hsing HW, Lai TC, Chen YW, Lee TR, Chan HT, et al. Trypsininduced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17:36.

26. Klingbeil MFG. Comparaçao de dois métodos de obtençao celular para cultura primária de queratinócitos bucais humanos [Dissertaçao de mestrado]. Sao Paulo:Universidade de Sao Paulo, Instituto Pesquisas Energéticas e Nucleares;2006.

27. Liu R, Desta T, He H, Graves DT. Diabetes alters the response to bacteria by enhancing fibroblast apoptosis. Endocrinology. 2004;145(6):2997-3003.

28. Falanga V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. Lancet. 2005;366(9498):1736-43.

29. Brem H, Stojadinovic O, Diegelmann RF, Entero H, Lee B, Pastar I, et al. Molecular markers in patients with chronic wounds to guide surgical debridement. Mol Med. 2007;13(1-2):30-9.










1. Enfermeira, mestrado em Enfermagem, doutorado em Ciências (Cirurgia Plástica) pela Universidade de Sao Paulo, professora assistente da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil.
2. Cirurgiao Plástico, doutorado em Ciências (Cirurgia Plástica) pela Universidade de Sao Paulo, responsável pelo Laboratório de Pesquisas em Cultura Celular e Feridas Cutâneas (LIM 04) da Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo (HCFMUSP), Sao Paulo, SP, Brasil.
3. Médico Assistente da Unidade de Queimaduras da Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da FMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.
4. Bióloga, Mestre, pesquisadora do Laboratório de Cultura Celular da Disciplina de Cirurgia Plástica do HCFMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.
5. Bióloga, Mestranda do HCFMUSP, Sao Paulo ,SP. Brasil.
6. Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo e Diretor Técnico de Divisao da Cirurgia Plástica do HCFMUSP, Sao Paulo, SP, Brasil.

Correspondência:
César Isaac
Laboratório de Investigaçao Médica (LIM 4) - Faculdade de Medicina USP
Avenida Doutor Arnaldo, 455 - sala 1360
Sao Paulo, SP, Brasil - CEP 01246-903
E-mail: cesaris@uol.com.br

Artigo recebido: 11/7/2011
Artigo aceito: 1/10/2011

Trabalho realizado no Laboratório de Pesquisas em Cultura Celular e Cicatrizaçao, Divisao de Cirurgia Plástica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil.